hth华体会安全网站：神经环路运用（35）丨RNAscope技能简介及原位杂交试验办法

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  RNAscope是一种高灵敏度、高特异性的原位杂交（ISH），大范围的运用于安排切片中单细胞乃至亚细胞水平的RNA定位与定量检测。

  单分子灵敏度：可在显微镜下看到离散的“点”，每个点代表一个RNA转录本；

  高特异性：双Z探针规划可区别单碱基差异（如SNP、剪接变体、骤变 vs 野生型）；

  第1天：对小鼠称重后，腹腔打针F17464或生理盐水，并将其独自置于笼中。30分钟后，再次腹腔打针MK-801或生理盐水，随后将小鼠放回原笼持续养殖60分钟。尔后，每隔4分钟取出一只小鼠，经过颈椎脱臼法施行安乐死随即断头。在无RNA酶条件下，敏捷取出脑安排，用生理盐水轻柔冲刷，吸水纸吸干剩下液体并按以下程序快速冷冻。

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  将8个Pyrex烧杯各参加250 ml异戊烷，置于装有干冰颗粒的聚苯乙烯泡沫箱中并在通风橱下排列成一行。运用超低温温度计监测异戊烷温度。当温度降至−20°C时，用刮刀敏捷拌和异戊烷构成漩涡。将小鼠脑安排悄悄置于漩涡外表，使其敏捷沉底并完结冷冻。随后，将含样本的烧杯持续置于干冰上静置30分钟，使安排温度充沛平衡至干冰温度。

  该办法可在血管离断后4分钟内完成大批量小鼠脑安排的均匀快速冷冻，有用保存安排形状及100%的方针mRNA，这关于低至中等表达水平的mRNA特别的重要。相比之下，白腊包埋安排约丢失25%的mRNA信号。需注意，若运用液氮等更低温度冷冻某些安排或许会呈现裂纹导致后续切片困难。整个操作在通风橱中进行并全程运用无RNA酶耗材。冷冻后的脑安排存放于−80°C的15 ml无RNA酶Eppendorf管中。第2天对剩下20只小鼠重复相同流程。一切冷冻脑样本用于RNAscope原位杂交检测c-fos mRNA表达。

  选用RNAscope®荧光原位杂交（FISH）技能查验测验小鼠脑安排中c-fos mRNA的表达水平。试验运用4%多聚甲醛后固定的冷冻冠状脑切片（10 μm厚）。选定5分钟轻度消化作为规范流程，因其在坚持安排形状完整性的一起取得最佳信噪比。

  染色流程依次为：ACD蛋白酶K处理→ 探针杂交→ 信号扩大→ LS缓冲液清洗 → Mixed Red Refine显色 → DAPI复染细胞核。染色完结后，载玻片经去离子水冲刷，60°C烘干，二甲苯通明并以Ecomount封片剂封片。封片后当即进行全片扫描或于–20°C避光短期保存。该流程根据ACD Bio的多级分支DNA（bDNA）信号扩大体系，在确保高特异性的一起完成单分子mRNA的可视化，为后续定量分析奠定根底。

  RNAscope 技能是神经环路研讨中精准定位基因表达的中心东西，凭仗单分子级灵敏度、高空间分辨率及多靶标一起检测的优势能在安排原位完成特定 RNA 的高分辨率可视化，其中心运用包含经过靶向神经元标志物 RNA（如 Slc17a7、Gad1）精准判定环路细胞构成，结合神经示踪技能同步检测投射神经元与功用基因（如受体、离子通道 RNA）以提醒环路衔接与基因表型的相关，以及在发育或病理状态下追寻突触蛋白、神经递质合成酶等要害基因的时空表达改变以说明环路可塑性机制，为解析神经环路的组成与功用供给了要害技能支撑。

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